Экспрессия — что это такое Экспрессивность в биологии, медицине и психологии

Коэкспрессия

Физико-химическая биология

Клиническая медицина

Профилактическая медицина

Медико-биологические науки

АРХИВ:

Фундаментальные исследования

Организация здравохраниения

История медицины и биологии

Последние публикации

Поиск публикаций

Архив : 2000 г. 2001 г. 2002 г.
2003 г. 2004 г. 2005 г.
2006 г. 2007 г. 2008 г.
2009 г. 2010 г. 2011 г.
2012 г. 2013 г. 2014 г.
2015 г. 2016 г. 2017 г.
2018 г. 2019 г. 2020 г.

Редакционная информация:
Опубликовать статью

  • Список членов редколлегии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
«Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства»
(ФГБУН ИТ ФМБА России)

Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

199406, Санкт-Петербург, ул.Гаванская, д. 49, корп.2

ТОМ 4, СТ. 131 (стр. 465-470) //

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

Е.Е.Зуева *
Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Резюме
Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга человека традиционно осуществляется методом проточной цитометрии и позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров одновременно. Использование многоцветного окрашивания требует корректной оценки получаемого изображения. Рассмотрены варианты коэкспрессии маркеров при проведении трехцветного окрашивания. Показана возможность оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе изображения в пространстве двумерной гистограммы.

Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, анализ изображения

Определение фенотипа клеток — как циркулирующих в крови, так и входящих в состав сложных тканей, на сегодняшний день не составляет особого труда. Для этого используют способность клеток связываться со специфическими антителами. Так как антитела могут быть получены практически к любому белку (или его фрагменту) с установленной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью соответствующей ДНК, то и иммунофенотипирование (ИФТ) может быть использовано практически в любых областях биологии и медицины 1 . В любом случае для визуализации целевых молекул используют антитела, меченные ферментами, металлами или флюорохромами. Проточная цитометрия (ПЦ), использующая в качестве метки моноклональных антител такие стабильные флюорохромы как флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), фикоэритрин (ФЭ), перидинин-хлорофилл протеин (Per CP) и др., обладает практически неограниченными возможностями по оценке клетки и ее компонентов. Выявление флюоресценции каждого из этих флюорохромов и усиление светового сигнала на фотоумножителях проточного цитометра позволяет одновременно получать информацию о физических параметрах клетки (размер и гранулярность) и о наличии/отсутствии экспрессии тех или иных антигенов (маркеров) 2 . Развитие технологий достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ золотым стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток 3 . Анализ коэкспрессии маркеров позволяет определять субпопуляционную принадлежность лимфоцитов и выявлять опухолевые клетки в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.

Пробоподготовка
Стандартная пробоподготовка для выявления поверхностных маркеров клеток периферической крови и костного мозга осуществляется по протоколам окрашивание-лизис-отмывка и окрашивание-лизис-без-отмывки 4 . При необходимости отсрочить анализ на 2-24 часа пробоподготовка может быть дополнена фиксацией клеток образца. При необходимости выявления внутриклеточных маркеров в протокол окрашивания должна быть включена процедура пермеабилизации 5 . При работе с клеточной суспензией, в которой по определению отсутствуют эритроциты (например, ликвор или суспензия мононуклеаров, полученная в результате градиентного центрифугирования) из протокола пробоподготовки может быть исключена процедура лизиса.

Учет результатов
Анализ антигенной экспрессии осуществляется на проточном цитометре с использованием программного обеспечения для анализа больших массивов данных. Возбуждение флюоресценции происходит при прохождении клеткой фокального пятна аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм). Учет флюоресценции осуществляется при 512-547 нм, 572-591 нм и более 610 нм для FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножителях соответственно. Таким образом, получают данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флюоресценции осуществляется средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с любым антителом оценивается при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотипическим контролем.

Представление данных
Данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражают на двумерных гистограммах FSC/SSC (прямое forward side scatter (FSC) и угловое side scatter (SSC) светорассеяние). Для сигнала по FSC и SSC обычно используют линейное усиление, сигналы флюоресценции могут быть усилены до четырех (пяти) декадной логарифмической шкалы. Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определяется по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применяется к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в полтора раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах. При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражены на одномерных четырехдекадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражены на двумерных четырех декадных log/log гистограммах (FL1/ FL2, FL2/ FL3 и FL3/ FL1). Квадранты в этих гистограммах (FL1/ FL2 (FITC/PE), FL2/ FL3 (PE/PerCP) и FL3/ FL1 (PerCP/FITC)) определяют две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на одной четверти шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате. Для анализа малоклеточных популяций могут быть также использованы смешанные линейно-логарифимированные гистограммы SSC/FL(1-3).

Читайте также:  Купить Экламиз таблетки 5 мг 10 мг упаковка контурная ячейковая №30 5 мг 10 мг в аптеках Москвы, Вла

Анализ данных
Анализ данных заключается в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме Fl2/Fl1 кластера событий, позитивного по обоим маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера (рис.1.)


Варианты экспрессии третьего маркера на популяции клеток, позитивной по двум маркерам. На гистограмме экспрессии антигенов 1 и 2 (Аг1 и Аг2) выявлен кластер событий, позитивный по обоим антигенам (А). Внутри этого кластера экспрессия антигена 3 (Аг3) может отсутствовать (кластеры Б и В), либо быть выражена (присутствовать) (кластеры Г и Д). Таким образом, получена возможность выявить внутри кластера А четыре варианта сочетаний экспрессии маркеров: Аг1 + Аг3 — (Б), Аг2 + Аг3 — (В), Аг1 + Аг3 + (Г) и Аг2 + Аг3 + (Д).

При одновременном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций (табл1),

Фотоумножитель Регистрация сигнала флюорохрома Обозначение кластера на гистограмме
Fl1 Fl2 Fl3
Fl1 А
+ Б
Fl2 + В
+ + Г
Fl3 + Д
+ + Е
+ + Ж
+ + + З

расположение которых в пространстве трех четырехдекадных гистограмм (FL1/Fl2, Fl2/Fl3, Fl3/Fl1) строго определено (рис.2).


Варианты сочетанной экспрессии (бинарный вариант). Варианты сочетанной экспрессии маркеров при трехцветном окрашивании. При совместном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций в пространстве трех двумерных гистограмм. Буквенные обозначения аналогичны табл. 1.

Такое изображение может быть получено при гомогенном характере экспрессии, т.е. в том случае, если все клетки популяции однородно экспрессируют каждый анализируемый маркер.

Анализ коэкспрессии маркеров
Далеко не во всех случаях, популяция, позитивная по экспрессии одного маркера, также однородно экспрессирует другой маркер. Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции может быть использована схема изображения возможных вариантов коэкспрессии в пространстве двумерной гистограммы (рис.3).

Типы коэкспрессии антигенов. На гистограмме А представлена однородная экспрессия Аг2 и неоднородная коэкспрессия Аг1 клетками анализируемой популяции. На гистограмме Б представлен обратный вариант однородной экспрессии Аг1, при котором неоднородным образом коэкспрессируется Аг2. На гистограмме В вяывлено две популяции: популяция Аг1+Аг2- и Аг2+ популяция, обладающая гетерогенной экспрессией Аг1+. На следующих двух гистограммах изображены популяции, позитивные по одному исследуемому маркеру и негативные по другому: на гистограмме Г — популяции Аг1-Аг2+ и Аг1+Аг2+, на гистограмме Д — популяции Аг1+Аг2- и Аг1+Аг2+. При получении результата, изображенного на гистограмме Е, корректная интерпретация данных затруднена в связи с высоким уровнем аутофлюоресценции Аг1-Аг2- и наличием мертвых клеток, которые неспецифически, в равных количествах, связывают маркеры обоих антигенов. Количественное совпадение относительного содержания популяций с одинаковым суммарным фенотипом, выявленных на различных гистограммах, является внутренним контролем качества пробоподготовки.

Фактически на двумерной гистограмме может быть представлено всего несколько вариантов коэкспрессии маркеров.

Заключение
Мультипараметрический анализ данных ПЦ основан на анализе изображения, отражающего гомогенный или гетерогенный характер экспрессии маркера (маркеров) изучаемой популяции. Процесс обработки данных может быть автоматизирован и стандартизован, однако далеко не все биологические образцы удовлетворяют условиям автоматической обработки изображения 6 . Следовательно, сохраняется роль эксперта, сопоставляющего данные ИФТ с морфологией и клинической картиной заболевания. Отрицательные результаты ПЦ также должны соответствовать результатам других исследований. Таким образом, максимальная точность в диагностике достигается при сочетанном использовании автоматизированного анализа изображения и экспертной оценки биологического образца и позволяет точно ответить на простой вопрос пациента: «Я болею лейкозом?»

* Адрес для переписки: Зуева Екатерина Евгеньевна, с.н.с. лаборатории молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова, ул. Л.Толстого, 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197089. Тел/факс: +7 812-2387194, e-mail: dinzu@mail.ru

1 Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Магки, М.,Мир, 1999, 506 стр.

2 Horsburg T., S. Martin, A.J.Robson The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transplant Immunology 2000, 8 (1):3-15.

3 Gelman R., Wilkening C. Analyses of quality assessment studies using CD45 for gating lymphocytes for CD3+CD4+%. Cytometry (Comm in Clin Cytometry) 2000; 42:1-4.

4 Gratama JW, Sutherland DR, Keeney M, Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15:14-22.

5 Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting enotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.

6 Cualing HD. Automated analysis in flow cytometry. Cytometry. 2000 Apr 15;42(2):110-3

Жидкостная цитология шейки матки и иммуноцитохимическое определение онкомаркеров р16ink4a и ki67

Где проводится: Во всех медицинских центрах и лабораториях «Тонус»

Срок выполнения: 7-10 рабочих дней

  • Описание
  • Подготовка
  • Показания
  • Интерпретация результатов

Жидкостная цитология шейки матки является новой стандартизированной технологией приготовления цитологического препарата. На сегодняшний день данный метод является самым информативным в диагностике интраэпителиальных неоплазий. Благодаря новой технологии количество ложных результатов значительно ниже, чем при использовании классических методов цитологического исследования мазка. Это достигается использованием специального стабилизирующего раствора и инструментов для взятия мазка – щеточки cervex-brush.

Жидкостная цитология шейки матки в современной медицине является очень важным исследованием. В настоящее время рак шейки матки занимает вторую позицию по распространенности рака среди женщин и согласно ВОЗ смертность от данной патологии быстро увеличивается.

Для того, чтобы рак шейки матки развился требуется длительное время. От появления интраэпителиальных поражений низкой и высокой степени до возникновения инвазивного рака должно пройти не менее 10 лет. Из этого можно сделать вывод, что у женщины достаточно времени, чтобы диагностировать начальные изменения и начать профилактику. Чаще в клиниках используются классические цитологические исследования мазка – окрашивание биоматериала по Папаниколау и Рар-тест. Эти цитологические методы часто дают ложноотрицательные результаты – до 40 процентов. Это обусловлено неадекватно приготовленным препаратом, нарушениями процедур взятия материала. При использовании жидкостной цитологии шейки матки частота ошибок значительно уменьшается.

Преимущества жидкостной цитологии шейки матки:

  • Отличное качество материала для анализа на цитологию
  • Длительное хранение биоматериала в специальном растворе, что дает возможность его хранить или транспортировать (без разрушения и потери клеток).
  • Приготовление препарата происходит быстро
  • Из одного материал можно приготовить несколько препаратов для анализа на цитологию
  • Методики окрашивания препарата стандартизированы

Таким образом, жидкостной цитологии шейки матки качество цитологического исследования мазка значительно повышается.

Анализ на цитологическое исследование мазка рекомендуется сдавать в качестве скрининга, даже когда симптомов нет. Сдать анализ на цитологию в первый раз следует через 3 года после начала половой жизни, либо при достижении 21 года. Скрининг необходимо проходить ежегодно. Если после 30 лет у женщины три последовательных отрицательных результата анализа на цитологию, то скрининг можно проходить раз в два-три года, но при наличии факторов риска (иммунодефицит, инфицирование ВПЧ) у женщины, ей необходимо анализ на цитологию ежегодно. Также скрининг следует проводить женщинам, у которых была удалена матка, но сохранена шейка матки. Ранняя диагностика при помощи жидкостной цитологии шейки матки позволяет вовремя выявить патологию и предотвратить развитие злокачественной опухоли, путем своевременного адекватного лечения.

Доказано, что ВПЧ (вирус папилломы человека) является фактором, который индуцирует развитие рака шейки матки. Значительно повышает эффективность скрининга определение клеточного протеин p16INK4a. Его экспрессия увеличивается при репликации онкобелков E6 и E7, которые реплицируются при интеграции вируса папилломы человека в генетический материал клеток эпителия шейки матки. В норме данный белок вырабатывает в очень малых количествах, которые нельзя обнаружить. При развитии канцерогенеза эпителия шейки матки это протеин синтезируются в больших количествах и дает возможность оценить дисплазию. Выявление p16INK4a является отличным дополнением к жидкостной цитологии шейки матки, так как совместное их применение позволяет выявить патологию на ранних стадиях развития (особенно CIN II, CIN III и начальные формы рака). Выявление заболевания на данных стадиях развития позволяет излечить пациентку практически в 100%.

Еще одним онкомаркером является антиген KI-67 – он также используется в рутинных исследованиях. Этот ядерный антиген позволяет выявить опухолевые клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла, на всем его протяжении. KI-67 позволяет определять опухолевую активность клеток, что существенно влияет на тактику дальнейшего ведения и лечения пациентов.

Сдать анализ на цитологию при профилактическом скрининге следует после пятого дня менструального цикла, а также спустя двое суток после полового контакта. Не рекомендуется проводить жидкостную цитологию шейки матки на фоне применение вагинальных лекарственных препаратов, лубрикантов, спермицидов, применения спринцеваний влагалища, а также во время месячных или при наличии генитальной инфекции.

Вышеперечисленные факторы не должны учитывать, если на шейке матки патология обнаруживается визуально.

Сдать анализ на цитологию следует для профилактического скрининга, данное исследование рекомендуется женщинам в возрасте от 21 до 65 лет.

1. Оценка адекватности образца:

  • Адекватный (при этом описывается клеточный состав)
  • Недостаточно адекватный (образец недостаточно адекватный по количественному и качественному составу, указывается причина (при этом описывается клеточный состав)
  • Неудовлетворительный образец для оценки (клеточного состава недостаточно для уверенного заключения)

2. Цитологическое описание

Описывает клеточный состав, клетки эпителия, отдельно описывается зона трансформации (метаплазия эпителия, цилиндрический эпителий). При наличии описываются интраэпителиальные изменения, которые также указываются в пункте №4.

3. Доброкачественные изменения:

  • Дегенеративные
  • Репаративные
  • Дискератоз, гиперкератоз, паракератоз
  • Бактериальный вагиноз
  • Увеличения ядер плоского, метаплазированного эпителия
  • Лучевые изменения

При отсутствии доброкачественных изменений отмечается, что они не обнаружены.

4. Патологические изменения в цитологическом исследовании мазка, согласно классификации, Bethesda:

  • ASC-US атипия плоского эпителия неясного значения;
  • ASC-H атипия плоского эпителия, не исключающая HSIL;
  • LSIL плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени;
  • HSIL плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени;
  • CIS карцинома in situ;
  • AG-US атипия железистого эпителия неясного значения;
  • AIS- эндоцервикальная карцинома in situ.

При отсутствии патологических изменений отмечается, что они не обнаружены.

5. Доп. уточнения.

Данный пункт может содержать информацию об обнаруженных грибках рода Кандида, бактериях, трихомонаде вагиналис и другой флоре.

Тест на p16INK4a оценивается совместно с жидкостной цитологией шейки матки. Положительный результат анализа на белок p16INK4a означает, что без соответствующего лечения данное состояние приведет к раку шейки матки.

Также, дается описательный ответ с указанием индекса пролиферативной активности (процент клеток, в которых определяется экспрессия антител к KI-67).

Коэкспрессия онкобелков p16/Ki67

  • Оксидативный стресс
  • HLA-Типирование
  • Аллергология
  • Аутоиммунные Заболевания
  • Биохимия Крови
  • Биохимия Мочи
  • Витамины, Жирные Кислоты
  • Гемостаз
  • Гемотология
  • Генетические Полиморфизмы
  • Гистологические исследования
  • Гормоны
  • Иммунологические Исследования
  • Исследования ДНК
  • Коммерческие Профили
  • Микробиологические Исследования
  • Молекулярная Диагностика
  • Нейромедиаторы: Биогенные амины и их метаболиты
  • Общеклинические Анализы
  • Онкология
  • Пренатальный Скрининг
  • Прочие Анализы
  • Серологические Маркеры
  • Стероидные гормоны и их метаболиты
  • Тяжёлые Металлы
  • Цитология

Рак шейки матки занимает второе место по частоте среди злокачественных новообразований репродуктивной системы у женщин после рака молочной железы. Доказана роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки. Важно вовремя выявить предраковые изменения шейки матки и предотвратить переход их в рак! Каждая женщина после начала половой жизни ежегодно должна проходить обследование у гинеколога, а для выявления предраковых изменений шейки матки 1 раз в 3-5 лет! В последнее время в акушерско-гинекологическую практику для раннего выявления предраковых изменений шейки матки, наряду с определением ВПЧ и цитологических мазков, активно внедряется определение белков р16 и Ki-67. Одновременная секреция их (коэкспрессия) свидетельствует о нарушении регуляции клеточного цикла и об онкологических изменениях эпителия шейки матки, вызванных вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска.

Условия подготовки определяются лечащим врачом. Соскоб из урогенитального тракта (у женщин: цервикальный канал): Мазки не следует брать: во время менструации; ранее 5 дней после использования вагинальных свечей, тампонов или спермицидов; после вагинального исследования (УЗИ малого таза, кольпоскопия), спринцевания; ранее 24-48 часов после полового контакта.

11 рабочих дней

Мы работаем с крупнейшими лабораторными комплексами России:

  • — Центр молекулярной диагностики CMD (Лаборатория ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзор)
  • — Клинико-диагностические лаборатории KDL
  • — Лаборатория ДНКОМ — научный центр молекулярно-генетических исследований (НЦМГИ)
  • — Лаборатория микробной хроматографии Медбазис
  • — Лаборатория новейших молекулярно-генетических исследований Медикал Геномикс
  • — Независимая лаборатория ИНВИТРО

— Цена указана без учета стоимости взятия биоматериала. При единовременном заказе нескольких услуг, услуга по сбору биоматериала оплачивается только один раз.

— Запись заранее не требуется, если у Вас остались какие-либо вопросы воспользуйтесь функцией «Обратный звонок», и мы Вам перезвоним

Лек Диагностик
С любовью, заботой и вниманием к Вашему Здоровью

Ссылка на основную публикацию
ЭКГ Медицинский центр «Президент-Мед»
ЭКГ - Электрокардиография Время проведения: 5-10 мин. Наличие противопоказаний: нет. Необходимость предварительной подготовки: нет. Ограничения: нет. Подготовка заключения: в течение...
Шприц одноразовый безопасный 0,5мл Луер-Лок игл 23G А1-001 иглы, шприцы оптовые цены в Новосибирске
Шприцы самоблокирующиеся. Шприц одноразовый самоблокирующийся предназначен для инъекций, диагностических пункций, отсасывания патологического содержимого из полостей. полностью исключить повторное использование; исключить...
Шугаринг или восковая депиляция что лучше
Восковая депиляция & шугаринг. Правда и мифы✅❌ Попробуем сравнить теперь восковую и сахарную депиляции. Просмотрев массу информации в Интернете, посетив...
ЭКГ (Электрокардиограмма без расшифровки)
ЭКГ (Электрокардиограмма без расшифровки) Электрокардиограмма (ЭКГ) — метод исследования сердца, с помощью записи на бумагу электрических колебаний от сердечной мышцы...
Adblock detector